Использование ферментов в качестве генетических маркеров

изоферменты,

Вступление. Изоферменты широко используются в практической работе с растениями. Одним из приоритетных путей их использования является анализ сцепления морфологических и изоферментных генов. Использование ферментов в качестве генетических маркеров позволяет определять группы сцепления и составлять генетические карты. Для многих растений составлены генетические карты, на которых локализованы также и изоферментных локусы, например кукуруза [1], соя [2,3], горох [4].

При наличии сцепления между морфологическими и изоферментных локусами, последние могут использоваться как маркеры важных морфо — биологических признаков. Например, у кукурузы обнаружено положительная связь между геном Amp3 и областью генома, принимает участие в формировании

© Л.В. Головань, В.К. Пузик, 2011. ISSN 0582-5075. Селекция и семеноводство. 2011. Выпуск 100.

длины начала и массы зерна [5]. У гороха обнаружено сцепления изофер-ментный локуса с генами, контролирующих устойчивость к вирусу желтой мозаики, что в свою очередь облегчает поиск устойчивых форм [6].

На данном этапе изучено лишь несколько групп сцепления в фасоли, полностью не составлены хромосомные карты. Так, была построена генетическая карта фасоли на основе 152 RAPD, 32 RFLPs и 12 SCARs маркеров [7]. Проанализирован генетический контроль таких ферментов: алкогольдегидро-геназы, малатдегидрогеназы, малин-энзима, 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы, шикиматдегидрогеназы [8,9,10], аконитазы, катодной Эстер-зи, диафоразы [11,12,13] и др.. Из всех этих локусов только между отдельными обнаружено сцепления, такими как Aco1-20cM-Dia1; Adh1-2cM-Got2 и Est2-11cM-Pha. [14] Но в литературе отсутствуют данные о сцеплении локусов, кодирующих морфологические признаки и изоферменты. В результате нами были проведены исследования по выявлению сцеплений между морфологическими и изоферментных локусами с целью их использования в селекционно-генетических исследованиях фасоли.

Методика и исходный материал. В работе были использованы образцы фасоли из коллекции Харьковского национального аграрного университета им. В. В. Докучаева (ХНАУ) и Национального центра генетических ресурсов растений Украины (НЦГРРУ) (табл. 1). Образцы интродуцированные из разных эколо-го-географических зон (Украина, Франция, США). Выбор растительного материала связан с использованием его в селекционном процессе по созданию исходного материала фасоли.

Таблица 1.

Перечень образцов фасоли, изучаемых

Исследования проводили в 2008-2010 гг Анализ проводили по известным морфологическим признакам. С помощью лабораторного микродре-лю высверливанием отбирали навеску с семядоли и анализировали спектр ферментов. Семена, взятое в анализ, выращивали на опытном поле. Посев проводили вручную в оптимальные сроки, при достижении растениями фазы цветения проводили скрещивания по методике ^ Buishand [15]. В качестве родительских форм использовали контрастные, гомозиготные по изученным признакам формы. Гибриды Fl самозапилювалы и проверяли полученное семян на гибридности по спектру изоферментов. У гибридов F2 сначала определяли расщепления по спектру изоферментов в сухом семенах (индивидуально), а затем в выращенных из них растений определяли расщепления по морфологическим признакам.

Морфологические признаки анализировали по характеру роста, типом куста, окраской цветка, боба и семена, пигментацией растения (присутствие, отсутствие).

Изоферментный спектр системы шикиматдегидрогеназы проявляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидному геле (ПААГ). Экстракция ферментов проводилась по отдельным семян 0,02 М Трис-HCl буфером (рН 7,5), который содержит 0,01 мМРУР; 0,006 мм ЭДТА; 0,01 мм ДТТ и 20% сахарозы, на холоде в течение одного часа.

Раствор для экстракции. Брали 2,175 г сахарозы; 217,5 мг PVP; 4,35 мг ЭДТА; 43,5 мг ДТТ и 10,88 мл Трис-HCl добавляли 200 мкл раствора в епиндорфы с мукой. Супернатант отделяли с помощью центрифугирования в течение 5 мин 7 тис.об / мин. Полученные экстракцией ферменты сразу используются для электрофореза.

Для распределения ферментов использовалась Трис-ЭДТА-боратного буферная система — 0,09 М Трис, 0,09 М Н3ВО3, 0,0031 М ЭДТА с рН 8,3 (концентрация акриламида и метиленбисакриламиду в геле составляла 7% и 0,37% соответственно ).

В качестве катализатора и инициатора реакции полимеризации использовали N’N’N’N-тетраметиленетилендиамин (ТЕМЕД) и персульфат аммония.

Режим электрофореза: вхождение белков в гель — 10 мин. при 80V, рабочий режим — 3 ч при 300V при температуре электродного буфера не выше 80С.

Гистохимическое окраски гелей осуществлялось по методике Шоу и Прассада с модификациями [16]. Аллозимы обозначали как F (наиболее анодный) и S (наименее подвижной апофермент).

Проверку нулевой гипотезы в соответствии фактического расщепления теоретически ожидаемому, а также тест на сцепление локусов изучали с использованием х2-критерия. Оценку сцепления и частоты кроссинговера вычисляли с использованием метода максимального правдоподобия [17].

Результаты и их обсуждение. Анализ наследования фермента шикиматдегидрогеназы. Шикиматдегидрогеназа (SKDH К.Ф.1.1.1.25). При гистохимическом окраске SKDH образцов фасоли нами было выявлено одну основную зону активности. Эта зона была представлена ??двухкомпонентным полиморфным спектром. Наличие в этой зоне активности фермента двух компонентов возможно связано с посттранскрипционная изменчивостью. Нами были выделены быстрый и медленный компоненты, которые могут соответствовать аллельных вариантов одного гена. Многокомпонентный спектр в пределах каждого исследуемого генотипа фасоли не расщеплялся, т.е. оставался постоянным, что свидетельствует о гомозиготность материала, якиы изучался, по генам, которые контролируют спектр шикиматдегидрогеназы (8КЭЫ). Было обнаружено, что некоторые компоненты, как в пределах одного генотипа, так и между разными генотипами, различались по своей интенсивности. Это может быть связано с различной ферментативной активностью и концентрацией фермента в исследуемых образцов.

Анализ гибридов Б! показал, что наследование данного признака происходит кодоминантных типу; изоферментный спектр характеризовался сочетанием компонентов, которые были обнаружены в родительских форм (рис.1). В результате анализа гибридов соотношение фенотипических классов шикиматдегидрогеназою составило 188:2 Р8: 1РБ, что соответствует теоретически ожидаемому расщеплению при моногенном наследовании (табл.2).

Данные расщепления подтверждают гипотезу о контроле шикиматдегидрогеназы одним геном с двумя кодоминантных аллелей. Молекула шикима-тдегидрогеназы является диммером гибридный спектр представлен тремя полосами.

Рис.1. Электрофореграмме шикиматдегидрогеназы фасоли обыкновенной

Анализ наследования морфологических признаков. Морфологические признаки, которые использовались в данной работе, достаточно стабильны и их изменение проявляется, в основном, в необычных для культуры фасоли климатических условиях. Так, например, в неблагоприятных для фасоли условиях (Ленинградская область) у сорта Сакса без волокна G 15 на слоеной пластинке отмечалась появление антоциановых пигментации в виде штриха. В условиях Украины пигментация отсутствовала [18].

Таблица 2.

Результаты расщепления по морфологическим и биохимическим признакам

SS-зона ферментативной активности SKDH SF — зона ферментативной активностиSKDH FF — зона ферментативной активносriSKDH K — кустовой тип куста ZV — с воем верхушкой тип куста AA — индетерминантный рост aa — детерминантный рост

Я — розовая окраска цветка

В — белая окраска цветка

Е — фиолетовая окраска цветка

БГ-светло-фиолетовую окраску цветка

Оп — белое семян

Вк — бело-коричневые семена

Кп — коричневые семена

ВЕЫ — бело-черное семян ЕЫ — черное семян Р — присутствует пигментация на растении УР — отсутствует пигментация на растении Р — присутствует пигментация боба

Анализ наследования морфологических признаков в выше указанных образцов и полученных в результате соответствующих скрещиваний гибридов показал следующие результаты.

Наследование характера роста. Из литературных источников известно, что характер роста стебля зависит от доминантного гена А (индетерминант-ный рост) и его рецессивного аллеля а (детерминантный рост) [19].

Нами при скрещивании растений с детерминантный ростом (сорт К-кучаевська) с растениями, имели индетерминантный рост (образец Holberg) в Fj все растения имели индетерминантный тип роста. В F2 наблюдали расщепление в соотношении 3АА: 1аа (112:42% 2 = 0,42), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования.

Растения родительских сортов Первомайска и Isex по характеру роста — детерминантные, все гибриды первого поколения были детерминант-ного типа роста. Анализ по типу роста в F2 этой гибридной комбинации не проводился.

Наследование типа куста. Вой верхушки растений фасоли определяется геном Finтa Эпистатический к нему геном neu [19]. Растения материнского сорта Докучаевска по типу куста — кустовые, вроде Holberg — кустовой из витков верхушкой. В Fj по типу куста все растения были кустовыми с воем верхушкой (Fin / neu). В ходе анализа гибридов F2 были получены следующие результаты: соотношение фенотипических классов в F2 по типу куста 3ZV: IK (112:42% 2 = 0,42), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследовании.

По типу куста вроде Первомайска — кустовой, отцовская форма (Isex) также кустовая. В Fj по типу куста все растения были кустовыми. Анализ по типу куста F2 этой гибридной комбинации не проводился (табл.2).

Наследование окраски цветка и семян. Наиболее стабильной признаком является окраска оболочки семян и окраска цветков. Установлены корреляции между окраской оболочки семян и окраске цветка. Сорта с белыми семенами имеют белый цветок, с черным — фиолетовый, с коричневым — розовую. Чем темнее окраска семян, тем интенсивнее окрашена цветок Это результат плейотропный действия доминантных генов R и ВИ [19].

При скрещивании растений с белой окраской цветка и семян (образец Докучаевска) с растениями, имели розовую окраску цветка и коричневую окраску семян (Holberg) в Fj все растения имели розовую окраску цветка и коричнево-белое семян. Розовый цветок образуется в присутствии гена Nud. Окраска семян — признак полигенная. На основании изучения наследственности сортов с различной окраской были предложены основные гены PiGm комплементарные к ним — C, J, Ins, Can, G, B, V, R, гены-модификаторы Flav, Och, Vsr и гены частичного окраски — T, Bip, Arc, Diff, Exp [J9].

Фактическое расщепление по окраске цветков составило 3R: 1B (121:33% 2 = 1,05), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследовании. Соотношение фенотипических классов в F2 по окраске семян составило 1Bn: 2Bk: 1Kn (33:91:30,% 2 = 5,22), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования (см. табл. 2). Расщепление по окраске цветка и семян произошло не только в количественном ай в качественном соотношении можно предположить наличие в генотипе генов-модификаторов.

При скрещивании растений с белым окраску цветка и семян (сорт Первомайска) с растениями, имели фиолетовую окраску цветков и черную окраску семян (образец Isex) в Fj все растения имели светло-фиолетовую окраску цветков и бело-черную окраску семян, то есть неполное доминирование окраски цветки и семена. Следовательно, в генотипе присутствуют гены Р, Т, V — цветок фиолетовая, белый цветок в родительской формы появляется в присутствии генов — P, T, v. Фактическое расщепление по окраске цветков F2 составило 1B: 2Sf: 1F (% 2 = 0,99), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования. Соотношение Феноти-печных классов в F2 по окраске семян составило 1Bn: 2BCh: 1Ch (% 2 = 0,99), что также соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования (табл.2). Поскольку по окраске цветка произошло расщепление не только в количественном, но и в качественном соотношении, можно предположить наличие генов — модификаторов.

Наследование пигментации на семядолях, стебле, и бобах. Сорт фасоли Докучаевска характеризовался отсутствием пигментации на семядолях, бобах и стебле. Образец Holberg — семядоли, боб и стебель с розовой пигментацией. В F1 по этим признакам отмечена наличие пигментации на семядолях, стебле и бобах. Соотношение фенотипических классов в F2 по пигментацией этих признаков 3P: 1VP (% 2 = 1,05), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследовании (см. табл. 2).

Сорт фасоли Первомайская характеризовался отсутствием пигментации на семядолях, стебле и бобах. Образец Isex характеризовался наличием фиолетовой пигментации на семядолях, стебле и бобах. Гибриды F1 характеризовались наличием фиолетовой пигментации на семядолях, стебле и бобе. Соотношение фенотипических классов в F2 по пигментацией семядолей, стебли и боба 3P: 1VP (% 2 = 0,05), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования.

Анализ сцепления морфологических и изоферментных локусов. Наличие полиморфизма по изоферментных системой в исследуемых образцах фасоли позволила провести анализ на совместное наследование генов, кодирующих эту ферментную систему, а также генов, отвечающих за наследование морфологических признаков (тип куста, характер роста, окраска цветка, пигментация на растении, окраска семян и др..). Проверка гипотезы на независимое наследование этих генов обнаружила следующие результаты:

1. По комбинации Докучаевска / Holberg соотношение фенотипов-вых классов составило 3:6:3:1:2:1 (для групп ? кйк + характер роста; ? кйк + окраска цветка; ? кйк + пигментация на растении, ? кйк + тип куста, окраска семян + характер роста и окраска семян + тип куста), и 9:3:3:1 (для групп характер роста + окраска цветка, окраска цветка + тип куста, характер роста + пигментация на растении и тип куста + пигментация на растении) . Так что эти гены относятся к разным группам сцепления. За парами признаков окраска семян + пигментация на растении, окраска цветка + пигментация на растении, окраска семян + окраска цветка и тип куста + характер роста установлено наличие рекомбинации. Процент рекомбинаций соответственно составил 72%, 15%, 72% и 8,7% (табл. 3).

Таблица 3.

Оценка сцепления между генами, которые контролируют изучены биохимические и морфологические признаки в комбинации скрещивания Докучаевска / Holberg

2. По комбинации ПервомайськаЛзех анализ наличия сцеплений показал следующее. Проверка гипотезы на независимое наследование генов обнаружила следующие результаты: соотношение фенотипических классов составило 3:6:3:1:2:1 (для группы ^ жй + пигменгация на растении) и 1:2:1:2:4:2:1: 2:1 (для групп ? & и% + окраска цветка и ? ? йй + окраска семян) (табл. 4). Гены, контролирующие эти признаки находятся в разных группах сцепления. За парами признаков окраска семян + пигментация на растении, окраска цветка + пигментация на растении и окраска семян + окраска цветка найдены рекомбинации, процент которых соответственно составил 0,0%, 0,0% и 37%.

Таблица 4.

Оценка сцепления между генами, которые контролируют изучены биохимические и морфологические признаки в комбинации скрещивания Первомайская / Иеех

Выводы. Таким образом, было установлено независимое наследования таких пар признаков: Skdh + характер роста; Skdh + окраска цветка; Skdh + пигментация на растении, Skdh + тип куста, окраска семян + характер роста, окраска семян + тип куста, характер роста + окраска цветка, окраска цветка + тип куста, характер роста + пигментация на растении и тип куста + пигментация на растении. Гены, контролирующие эти признаки, очевидно, расположены на разных хромосомах и могут служить маркерами различных групп сцепления. За парами других признаков, а именно окраска семян + пигментация на растении, окраска цветка + пигментация на растении, окраска семян-ния + окраска цветка и тип куста + характер роста (только для комбинации Докучаевска / Holberg) установлено сцепление генов и вычислен процент рекомбинаций.

Введение в анализ генов, в том числе, определяющие важные сельскохозяйственные признаки, даст возможность не только составлять генетические карты фасоли, но и, возможно, использовать изоферменты как маркеры важных для селекции признаков.