В результате проведенных исследований было установлено независимое наследования таких пар признаков: Skdh + характер роста; Skdh + окраска цветка; Skdh + пигментация на растении, Skdh + тип куста, окраска семян + характер роста, окраска семян + тип куста, характер роста + окраска цветка , окраска цветка + тип куста, характер роста + пигментация на растении и тип куста + пигментация на растении. Гены, контролирующие эти признаки, очевидно, расположены на разных хромосомах и могут служить маркерами различных групп сцепления. За парами других признаков, а именно: окраска семян + пигментация на растении, окраска цветка + пигментация на растении, окраска семян + окраска цветка и тип куста + характер роста (только для комбинации Докучаевска / Holberg) установлено сцепление генов и вычислен процент рекомбинаций.

Введение в анализ генов, в том числе, определяющие важные сельскохозяйственные признаки, даст возможность не только составлять генетические карты фасоли, но и, возможно, использовать изоферменты как маркеры важных для селекции признаков.

Морфологические признаки, локус, ген, изофермент, Ph, vulgaris

Вступление. Изоферменты широко используются в практической работе с растениями. Одним из приоритетных путей их использования является анализ сцепления морфологических и изоферментных генов. Использование ферментов в качестве генетических маркеров позволяет определять группы сцепления и составлять генетические карты. Для многих растений составлены генетические карты, на которых локализованы также и изоферментных локусы, например кукуруза [1], соя [2,3], горох [4].

При наличии сцепления между морфологическими и изоферментных локусами, последние могут использоваться как маркеры важных морфо — биологических признаков. Например, у кукурузы обнаружено положительная связь между геном Amp3 и областью генома, принимает участие в формировании

© Л.В. Головань, В.К. Пузик, 2011. ISSN 0582-5075. Селекция и семеноводство. 2011. Выпуск 100.

длины начала и массы зерна [5]. У гороха обнаружено сцепления изофер-ментный локуса с генами, контролирующих устойчивость к вирусу желтой мозаики, что в свою очередь облегчает поиск устойчивых форм [6].

На данном этапе изучено лишь несколько групп сцепления в фасоли, полностью не составлены хромосомные карты. Так, была построена генетическая карта фасоли на основе 152 RAPD, 32 RFLPs и 12 SCARs маркеров [7]. Проанализирован генетический контроль таких ферментов: алкогольдегидро-геназы, малатдегидрогеназы, малин-энзима, 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы, шикиматдегидрогеназы [8,9,10], аконитазы, катодной Эстер-зи, диафоразы [11,12,13] и др.. Из всех этих локусов только между отдельными обнаружено сцепления, такими как Aco1-20cM-Dia1; Adh1-2cM-Got2 и Est2-11cM-Pha. [14] Но в литературе отсутствуют данные о сцеплении локусов, кодирующих морфологические признаки и изоферменты. В результате нами были проведены исследования по выявлению сцеплений между морфологическими и изоферментных локусами с целью их использования в селекционно-генетических исследованиях фасоли.

Методика и исходный материал. В работе были использованы образцы фасоли из коллекции Харьковского национального аграрного университета им. В. В. Докучаева (ХНАУ) и Национального центра генетических ресурсов растений Украины (НЦГРРУ) (табл. 1). Образцы интродуцированные из разных эколо-го-географических зон (Украина, Франция, США). Выбор растительного материала связан с использованием его в селекционном процессе по созданию исходного материала фасоли.

Таблица 1.

Перечень образцов фасоли, изучаемых

Исследования проводили в 2008-2010 гг Анализ проводили по известным морфологическим признакам. С помощью лабораторного микродре-лю высверливанием отбирали навеску с семядоли и анализировали спектр ферментов. Семена, взятое в анализ, выращивали на опытном поле. Посев проводили вручную в оптимальные сроки, при достижении растениями фазы цветения проводили скрещивания по методике ^ Buishand [15]. В качестве родительских форм использовали контрастные, гомозиготные по изученным признакам формы. Гибриды Fl самозапилювалы и проверяли полученное семян на гибридности по спектру изоферментов. У гибридов F2 сначала определяли расщепления по спектру изоферментов в сухом семенах (индивидуально), а затем в выращенных из них растений определяли расщепления по морфологическим признакам.

Морфологические признаки анализировали по характеру роста, типом куста, окраской цветка, боба и семена, пигментацией растения (присутствие, отсутствие).

Изоферментный спектр системы шикиматдегидрогеназы проявляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидному геле (ПААГ). Экстракция ферментов проводилась по отдельным семян 0,02 М Трис-HCl буфером (рН 7,5), который содержит 0,01 мМРУР; 0,006 мм ЭДТА; 0,01 мм ДТТ и 20% сахарозы, на холоде в течение одного часа.

Раствор для экстракции. Брали 2,175 г сахарозы; 217,5 мг PVP; 4,35 мг ЭДТА; 43,5 мг ДТТ и 10,88 мл Трис-HCl добавляли 200 мкл раствора в епиндорфы с мукой. Супернатант отделяли с помощью центрифугирования в течение 5 мин 7 тис.об / мин. Полученные экстракцией ферменты сразу используются для электрофореза.

Для распределения ферментов использовалась Трис-ЭДТА-боратного буферная система — 0,09 М Трис, 0,09 М Н3ВО3, 0,0031 М ЭДТА с рН 8,3 (концентрация акриламида и метиленбисакриламиду в геле составляла 7% и 0,37% соответственно ).

В качестве катализатора и инициатора реакции полимеризации использовали N’N’N’N-тетраметиленетилендиамин (ТЕМЕД) и персульфат аммония.

Режим электрофореза: вхождение белков в гель — 10 мин. при 80V, рабочий режим — 3 ч при 300V при температуре электродного буфера не выше 80С.

Гистохимическое окраски гелей осуществлялось по методике Шоу и Прассада с модификациями [16]. Аллозимы обозначали как F (наиболее анодный) и S (наименее подвижной апофермент).

Проверку нулевой гипотезы в соответствии фактического расщепления теоретически ожидаемому, а также тест на сцепление локусов изучали с использованием х2-критерия. Оценку сцепления и частоты кроссинговера вычисляли с использованием метода максимального правдоподобия [17].

Результаты и их обсуждение. Анализ наследования фермента шикиматдегидрогеназы. Шикиматдегидрогеназа (SKDH К.Ф.1.1.1.25). При гистохимическом окраске SKDH образцов фасоли нами было выявлено одну основную зону активности. Эта зона была представлена ??двухкомпонентным полиморфным спектром. Наличие в этой зоне активности фермента двух компонентов возможно связано с посттранскрипционная изменчивостью. Нами были выделены быстрый и медленный компоненты, которые могут соответствовать аллельных вариантов одного гена. Многокомпонентный спектр в пределах каждого исследуемого генотипа фасоли не расщеплялся, т.е. оставался постоянным, что свидетельствует о гомозиготность материала, якиы изучался, по генам, которые контролируют спектр шикиматдегидрогеназы (8КЭЫ). Было обнаружено, что некоторые компоненты, как в пределах одного генотипа, так и между разными генотипами, различались по своей интенсивности. Это может быть связано с различной ферментативной активностью и концентрацией фермента в исследуемых образцов.

Анализ гибридов Б! показал, что наследование данного признака происходит кодоминантных типу; изоферментный спектр характеризовался сочетанием компонентов, которые были обнаружены в родительских форм (рис.1). В результате анализа гибридов соотношение фенотипических классов шикиматдегидрогеназою составило 188:2 Р8: 1РБ, что соответствует теоретически ожидаемому расщеплению при моногенном наследовании (табл.2).

Данные расщепления подтверждают гипотезу о контроле шикиматдегидрогеназы одним геном с двумя кодоминантных аллелей. Молекула шикима-тдегидрогеназы является диммером гибридный спектр представлен тремя полосами.

Рис.1. Электрофореграмме шикиматдегидрогеназы фасоли обыкновенной

Анализ наследования морфологических признаков. Морфологические признаки, которые использовались в данной работе, достаточно стабильны и их изменение проявляется, в основном, в необычных для культуры фасоли климатических условиях. Так, например, в неблагоприятных для фасоли условиях (Ленинградская область) у сорта Сакса без волокна G 15 на слоеной пластинке отмечалась появление антоциановых пигментации в виде штриха. В условиях Украины пигментация отсутствовала [18].

Таблица 2.

Результаты расщепления по морфологическим и биохимическим признакам

SS-зона ферментативной активности SKDH SF — зона ферментативной активностиSKDH FF — зона ферментативной активносriSKDH K — кустовой тип куста ZV — с воем верхушкой тип куста AA — индетерминантный рост aa — детерминантный рост

Я — розовая окраска цветка

В — белая окраска цветка

Е — фиолетовая окраска цветка

БГ-светло-фиолетовую окраску цветка

Оп — белое семян

Вк — бело-коричневые семена

Кп — коричневые семена

ВЕЫ — бело-черное семян ЕЫ — черное семян Р — присутствует пигментация на растении УР — отсутствует пигментация на растении Р — присутствует пигментация боба

Анализ наследования морфологических признаков в выше указанных образцов и полученных в результате соответствующих скрещиваний гибридов показал следующие результаты.

Наследование характера роста. Из литературных источников известно, что характер роста стебля зависит от доминантного гена А (индетерминант-ный рост) и его рецессивного аллеля а (детерминантный рост) [19].

Нами при скрещивании растений с детерминантный ростом (сорт К-кучаевська) с растениями, имели индетерминантный рост (образец Holberg) в Fj все растения имели индетерминантный тип роста. В F2 наблюдали расщепление в соотношении 3АА: 1аа (112:42% 2 = 0,42), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования.

Растения родительских сортов Первомайска и Isex по характеру роста — детерминантные, все гибриды первого поколения были детерминант-ного типа роста. Анализ по типу роста в F2 этой гибридной комбинации не проводился.

Наследование типа куста. Вой верхушки растений фасоли определяется геном Finтa Эпистатический к нему геном neu [19]. Растения материнского сорта Докучаевска по типу куста — кустовые, вроде Holberg — кустовой из витков верхушкой. В Fj по типу куста все растения были кустовыми с воем верхушкой (Fin / neu). В ходе анализа гибридов F2 были получены следующие результаты: соотношение фенотипических классов в F2 по типу куста 3ZV: IK (112:42% 2 = 0,42), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследовании.

По типу куста вроде Первомайска — кустовой, отцовская форма (Isex) также кустовая. В Fj по типу куста все растения были кустовыми. Анализ по типу куста F2 этой гибридной комбинации не проводился (табл.2).

Наследование окраски цветка и семян. Наиболее стабильной признаком является окраска оболочки семян и окраска цветков. Установлены корреляции между окраской оболочки семян и окраске цветка. Сорта с белыми семенами имеют белый цветок, с черным — фиолетовый, с коричневым — розовую. Чем темнее окраска семян, тем интенсивнее окрашена цветок Это результат плейотропный действия доминантных генов R и ВИ [19].

При скрещивании растений с белой окраской цветка и семян (образец Докучаевска) с растениями, имели розовую окраску цветка и коричневую окраску семян (Holberg) в Fj все растения имели розовую окраску цветка и коричнево-белое семян. Розовый цветок образуется в присутствии гена Nud. Окраска семян — признак полигенная. На основании изучения наследственности сортов с различной окраской были предложены основные гены PiGm комплементарные к ним — C, J, Ins, Can, G, B, V, R, гены-модификаторы Flav, Och, Vsr и гены частичного окраски — T, Bip, Arc, Diff, Exp [J9].

Фактическое расщепление по окраске цветков составило 3R: 1B (121:33% 2 = 1,05), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследовании. Соотношение фенотипических классов в F2 по окраске семян составило 1Bn: 2Bk: 1Kn (33:91:30,% 2 = 5,22), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования (см. табл. 2). Расщепление по окраске цветка и семян произошло не только в количественном ай в качественном соотношении можно предположить наличие в генотипе генов-модификаторов.

При скрещивании растений с белым окраску цветка и семян (сорт Первомайска) с растениями, имели фиолетовую окраску цветков и черную окраску семян (образец Isex) в Fj все растения имели светло-фиолетовую окраску цветков и бело-черную окраску семян, то есть неполное доминирование окраски цветки и семена. Следовательно, в генотипе присутствуют гены Р, Т, V — цветок фиолетовая, белый цветок в родительской формы появляется в присутствии генов — P, T, v. Фактическое расщепление по окраске цветков F2 составило 1B: 2Sf: 1F (% 2 = 0,99), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования. Соотношение Феноти-печных классов в F2 по окраске семян составило 1Bn: 2BCh: 1Ch (% 2 = 0,99), что также соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования (табл.2). Поскольку по окраске цветка произошло расщепление не только в количественном, но и в качественном соотношении, можно предположить наличие генов — модификаторов.

Наследование пигментации на семядолях, стебле, и бобах. Сорт фасоли Докучаевска характеризовался отсутствием пигментации на семядолях, бобах и стебле. Образец Holberg — семядоли, боб и стебель с розовой пигментацией. В F1 по этим признакам отмечена наличие пигментации на семядолях, стебле и бобах. Соотношение фенотипических классов в F2 по пигментацией этих признаков 3P: 1VP (% 2 = 1,05), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследовании (см. табл. 2).

Сорт фасоли Первомайская характеризовался отсутствием пигментации на семядолях, стебле и бобах. Образец Isex характеризовался наличием фиолетовой пигментации на семядолях, стебле и бобах. Гибриды F1 характеризовались наличием фиолетовой пигментации на семядолях, стебле и бобе. Соотношение фенотипических классов в F2 по пигментацией семядолей, стебли и боба 3P: 1VP (% 2 = 0,05), что соответствует теоретически ожидаемому при моногенном наследования.

Анализ сцепления морфологических и изоферментных локусов. Наличие полиморфизма по изоферментных системой в исследуемых образцах фасоли позволила провести анализ на совместное наследование генов, кодирующих эту ферментную систему, а также генов, отвечающих за наследование морфологических признаков (тип куста, характер роста, окраска цветка, пигментация на растении, окраска семян и др..). Проверка гипотезы на независимое наследование этих генов обнаружила следующие результаты:

1. По комбинации Докучаевска / Holberg соотношение фенотипов-вых классов составило 3:6:3:1:2:1 (для групп ? кйк + характер роста; ? кйк + окраска цветка; ? кйк + пигментация на растении, ? кйк + тип куста, окраска семян + характер роста и окраска семян + тип куста), и 9:3:3:1 (для групп характер роста + окраска цветка, окраска цветка + тип куста, характер роста + пигментация на растении и тип куста + пигментация на растении) . Так что эти гены относятся к разным группам сцепления. За парами признаков окраска семян + пигментация на растении, окраска цветка + пигментация на растении, окраска семян + окраска цветка и тип куста + характер роста установлено наличие рекомбинации. Процент рекомбинаций соответственно составил 72%, 15%, 72% и 8,7% (табл. 3).

Таблица 3.

Оценка сцепления между генами, которые контролируют изучены биохимические и морфологические признаки в комбинации скрещивания Докучаевска / Holberg

2. По комбинации ПервомайськаЛзех анализ наличия сцеплений показал следующее. Проверка гипотезы на независимое наследование генов обнаружила следующие результаты: соотношение фенотипических классов составило 3:6:3:1:2:1 (для группы ^ жй + пигменгация на растении) и 1:2:1:2:4:2:1: 2:1 (для групп ? & и% + окраска цветка и ? ? йй + окраска семян) (табл. 4). Гены, контролирующие эти признаки находятся в разных группах сцепления. За парами признаков окраска семян + пигментация на растении, окраска цветка + пигментация на растении и окраска семян + окраска цветка найдены рекомбинации, процент которых соответственно составил 0,0%, 0,0% и 37%.

Таблица 4.

Оценка сцепления между генами, которые контролируют изучены биохимические и морфологические признаки в комбинации скрещивания Первомайская / Иеех

Выводы. Таким образом, было установлено независимое наследования таких пар признаков: Skdh + характер роста; Skdh + окраска цветка; Skdh + пигментация на растении, Skdh + тип куста, окраска семян + характер роста, окраска семян + тип куста, характер роста + окраска цветка, окраска цветка + тип куста, характер роста + пигментация на растении и тип куста + пигментация на растении. Гены, контролирующие эти признаки, очевидно, расположены на разных хромосомах и могут служить маркерами различных групп сцепления. За парами других признаков, а именно окраска семян + пигментация на растении, окраска цветка + пигментация на растении, окраска семян-ния + окраска цветка и тип куста + характер роста (только для комбинации Докучаевска / Holberg) установлено сцепление генов и вычислен процент рекомбинаций.

Введение в анализ генов, в том числе, определяющие важные сельскохозяйственные признаки, даст возможность не только составлять генетические карты фасоли, но и, возможно, использовать изоферменты как маркеры важных для селекции признаков.