В статье изложены результаты разработки и оптимизации новейших методов селекции и исследования генотипов винограда нового поколения с использованием современных биотехнологий (культура тканей ипуииго, ДНК-анализ) и усовершенствованных классических методов. Доказана возможность получения полноценных растений винограда из недозрелых семян, что будет способствовать выделению раннеспелых крупноплодных генотипов винограда. С целью ускорения селекционного процесса и изучение адаптивных свойств новых генотипов винограда применен изучения солевитривалости и засухоустойчивости в контролируемых условиях культуры тканей ипуииго. Эффективно использованы методы генетического и молекулярно — генетического анализа на различных этапах селекционного процесса для исследования полиморфизма гибридов, сортов и клонов винограда.

Генотипы винограда, адаптивные показатели, культура тканей ипуииго, ДНК-анализ, методы селекции винограда

Динамика спроса и предложения на рынке виноградарской продукции побуждает селекционеров к созданию новых сортов, наиболее отвечающих спросу потребителей [1].

Переход к биологическому виноградарства и повышение требований к экологической чистоте продукции расширяют комплекс показателей и свойств, которые должны иметь сорта винограда нового поколения. Особое значение приобретают адаптационные свойства к биотическим и абиотическим факторам среды. Новые генотипы винограда должны совмещать показатели высокой технологичности и производительности с адаптивностью.

Продолжительность селекционного процесса и изменчивость спроса потребителей часто препятствует распространению сорта в разных регионах виноградарства. Ускорению и углублению изучения адаптационных свойств перспективных форм винограда способствует использование в селекционном процессе современных биотехнологических [2] и ДНК-методов, требующих

© И. А. Ковалева, Л. В. Герус, Н. М. Зеленянська, В. Р. Бочарова, Н. А. Мулюкина, 2011. ISSN 0582-5075. Селекция и семеноводство. 2011. Выпуск 100.

постоянной оптимизации в зависимости от выбранной цели, селекционного задания и сорта.

Целью нашей работы была разработка и оптимизация современных биота-хнологичних методов для ускорения процесса селекции и изучения хозяйственно ценных показателей винограда.

В качестве материала использовали сорта винограда различных направлений использования, преимущественно селекции ННЦ «ИВиВ им. В.Е. Таирова». В работе применены методикультивування незрелых зародышей и микропаго-нов винограда in vitro, метод микросателлитных маркеров.

Селекционной работе с ранними сортами часто препятствует формированию у них неполноценного семян с недоразвитым зародышем. В обычных условиях получить сеянцы из таких семян сложно — они выходят нежизнеспособными, или не выходят вовсе.

Проведенные отделом селекции и лабораторией культуры тканей испытания по выращиванию незрелых зародышей в культуре in vitro доказали возможность индуцирования развития зародыша и получения жизнеспособного растения на питательной среде с добавлением регуляторов роста.

В культуре in vitro в течение 2007-2009 годов проводилось культивирования незрелых зародышей восьми комбинаций скрещивания, которые были взяты на 30, 60 и 90 день после опыления. Для исследования в in vitro отобрали зародыши семян четырех комбинаций ранних и крупноплодных столовых сортов: Кеша х Кардишах, Кеша х Смена, Августин х Кардишах, Восторг х Кобзарь. Наивысший результат (66,7% проростков) было получено в комбинации Августин х Кардишах при отборе проб на 60 день после опыления. В варианте Кеша х Кардишах проростки полученные при отборе на 60 и 90 день. Они существенно между собой не отличались и составили 40-41,7% от общего количества отобранных зародышей.

В комбинациях Восторг х Кобзарь и Кеша х Смена процент жизнеспособных растений был низким при любых сроков отбора. При разрезе семян, которые не проросли, было обнаружено, что зона эндосперма была нежизнеспособна, бурого цвета.

Установлено, что для повышения уровня эмбриогенеза и получения эм-бриоидив путем соматического эмбриогенеза эффективнее были ранние сроки отбора (30-й день после опыления). Для прорастания семенных зародышей и образование жизнеспособных проростков зависимости от комбинации скрещивания лучшими были средние и поздние отборы (60-й и 90-й дни). Все полученные проростки характеризовались Разнокачественность, часто морфологически отличались от родительских форм. Встречались проростки с различными морфологическими изменениями. Только в комбинациях Кеша х Кардишах и Августин х Кардишах получено полноценные растения. После прохождения адаптации они были высажены в селекционную теплицу для дальнейшего изучения.

Одним из способов определения засухоустойчивости винограда invitro является применение в составе питательных сред, високоосмотичнои вещества полиэтиленгликоля (ПЭГ). На стрессовое среду Мурасиге и Скуга (МС) + ПЭГ пересаживают растения с хорошо развитым приростом и корневой системой и устанавливают критические для каждого сорта концентрации ПЭГ. Так, например, для микроклонив сорта Мускат гамбургский 2034 эти концентрации составляли 3,% и 4,0%. Наблюдения, которые проводили в течение первых 7 дней, показали, что микроклоны опытных вариантов обоих сортов отличались от контрольных существенной потерей тургора листовых пластинок, а через 14 -15 дней у всех были заметны внешние признаки осмотического шока — подсыхания и скручивание листьев, особенно страдали верхушки побегов . За счет усыхания апикальной части в микроклонив опытных вариантов уменьшалась высота, количество листьев и междоузлий. Контрольные растения, наоборот, отличались увеличением этих показателей, что свидетельствует об активных ростовые процессы. Так, в микроклонив сорта Мускат гамбургский 2034, которые культивировали на МС + ПЭГ 3,0% и 4,0% концентрации, высота растений уменьшалась относительно исходной на 28,9% — 31,2%, количество листьев и междоузлий — вдвое (на 51,1% при выращивании на МС + ПЭГ 3% и 56,2% на МС + ПЭГ 4%). У растений контрольных вариантов вышеупомянутые показатели увеличивались соответственно на 20,4% (высота микроклонив) и на 30,0% (количество листьев и междоузлий).

Для подтверждения полученных результатов по вариантам опыта проводили определение основных показателей водного режима листьев и побегов исследуемых микроклонив (рис. 1). Установлено, что наиболее общей и легкозатримуванои воды было в листьях микроклонив контрольных вариантов: количество общей воды составляла 86,9-88,2%, легкозат-римуванои 80,0-84,0%. В опытных вариантах эти показатели находились на уровне 69,4-73,4% в Шардоне 4876 и 76,7-78,7% в Муската гамбургского 2034. Необходимо отметить, что для микроклонив винограда сорта Шардоне 4876 при 4,0% концентрации ПЭГ в среде содержание общей воды и ее легкозатримуванои фракции был больше по сравнению с Мускат гамбургский 2034, что может свидетельствовать о высшем засухоустойчивость этого сорта. Достоверной разницы между показателями водного режима в побегах отмечено не было.

Также было проведено определение содержания пигментов в тканях листьев микроклонив. Определено, что опытные растения, которые находились в условиях водного стресса, как правило, содержали большее количество хлорофиллов и каротиноидов по сравнению с контрольными. Так, по сравнению с контролем в тканях листьев растений Шардоне 4876, перенесенных на питательную среду МС + ПЭГ, наблюдали существенное увеличение количества хлорофилла «а» — на 10,9-24,4% и хлорофилла «Ь» — на 9,0-12 , 2%, каротиноидов на 16,136,7% по сравнению с контролем.

Как известно, чем меньше меняется сумма хлорофиллов после воздействия засухи, тем меньше изменяются пластиды листа, тем устойчивее сорт к воздействию стресса.

Рис. 1. Основные показатели водного режима листьев и побегов микроклонив винограда при наличии ПЭГ в питательной среде (среднее за 2007-2010 гг.)

На основе этого можно сделать вывод, что устойчивым к водного дефицита среди исследуемых сортов является сорт Шардоне, что совпадает с его общеизвестными характеристиками.

Солеустойчивость. Для изучения устойчивости винограда к засолению хло-ридного, сульфатного и карбонатного типа были выбраны подвойных сорта винограда-Кречунел 2, РхР 101-14 и новые подвоя Добрыня и Таировсь-кий 1. В работе использовали широкий спектр концентраций солей, чтобы установить нормальные, адаптивные, экстремальные и летальные уровне засоления.

Во время культивирования микроклонив винограда на засоленных средах были заметны визуальные признаки влияния солей. В микроклонив обнаружили поврежденные, некротические участки и хлороз листьев, усыхание верхушек прироста или основания стебля, приостанавливалось рост корневой системы. За счет усыхания (в случае карбонатного и хлоридного засоления) уменьшалась высота стебля и количество листьев, а при засоле сульфатами замедлялся рост и развитие растений. Растения контрольного варианта всех сортов нормально развивались на протяжении периода наблюдений. Растений сорта Кречунел 2 характеризовались увеличением высоты стебля за 7 дней на 11,5% и количеством листьев на 10,5%, а микроклоны винограда сорта 101-14 — соответственно на 18,0% и 21,4%. Содовое засоления 0,1% несколько угнетало рост стебля винограда сорта Кречунел 2

(На 3,4%), а увеличение количества соли до 0,2% привело к усыханию стебли на 16,5% и значительного уменьшения количества листьев — на 65,0%. В микро-клонов винограда сорта 101 -14 заметили незначительное снижение прироста (на 1,5-2,7%), однако количество листьев значительно уменьшалась — на 41,3-43,8% при наличии в среде 0,15 и 0, 2% соды.

На 7-й день исследований у растений контрольного варианта сорта Таи-Островский 1 отметили увеличение высоты стебля сравнению с исходной на 15,7%, листьев — соответственно на 18,0%. В вариантах с сульфатным типом засоления невысоких концентраций (0,4-0,8% Na2SO4) прирост стебля был несколько ниже и составлял 5,1-11,5%, в варианте с высоким содержанием соли рост микроклонив приостанавливалось. В случае внесения в питательную среду карбонатов наблюдали усыхания стебля и отмирания листьев уже на 7-й день после пересадки. В течение 20 дней после пересадки растений на среду, засоленные 0,1% высота микроклонив этого сорта

уменьшалась на 4,1-9,7%, а в вариантах с 0,4-0,8% — на 27,8-38,7%. У растений винограда сорта Таировское 1 варианту, где засоление создавали, добавляя СаС03 в количестве 10,0-17,0%, не отмечено морфологических изменений у растений на 7-й день исследований, однако через 20 дней в отдельных микрокло-нов наблюдалось значительное повреждение нижних листьев (вариант с концентрацией 10,0% СаС03), а также частично — листьев среднего яруса (14,0% CaCO3), в некоторых случаях проявлялись признаки хлороза. Для растений, пересаженных на среду с низким содержанием мела, отметили хороший прирост стебля и листьев, однако впоследствии наблюдали усушки вегетативной массы микроклонив. Подобную тенденцию отмечено и для вариантов с высшим концентрацией СаС03. Для растений подвойных сорта — Доб-риня — отмечено подобную тенденцию к изменению показателей роста микрокло-нов, однако в целом повреждений у растений было больше, что может свидетельствовать о хуже перенос условий модельного засоления виноградом этого сорта.

Для вариантов, где создавали сульфатный тип засоления, использованы концентрации (0,1-0,3% MgSO4, 0,4-1,0% Na2SO4) не повлияли видимо на развитие микроклонив, за исключением варианта с высоким содержанием Na2SO4, где растения имели бурые некротические участки на листовых пластинках. На среде с сульфатом магния для микроклонив характерны хорошие показатели роста — на уровне контрольных и выше. Также отметили появление новых корней у всех растений. На среде с низким содержанием Na2SO4 у растений наблюдали значительный прирост стебля уже на 7-й день исследований (20,3%), культивирования на среде с высоким содержанием этой солипризвело к замедлению роста микроклонив и количества листьев; также только в части растений (40, 0%) восстанавливались корни.

Для изучения влияния хлоридного засоления в питательную среду вносили 1,0-3,0% № С1. Уже ниже концентрация соли привела к видимого повреждения растений: высыхали листья нижнего и среднего яруса, в случае высоких концентраций поражения было сильнее. Однако в микроклонив варианта с низким содержанием хлорида высота стебля росла на 19,6%, а количество листьев уменьшалась на 3,2%. Повышение содержания хлорида натрия в среде привело к усыханию верхушки прироста на 16,6-25,7% и повреждения листьев на 6,8% (вариант 2% NaCl) и на 70,5% (вариант 3,0% NaCl). На 20-й день культивирования на засоленном хлоридами среде погибли растения всех вариантов, кроме того, где концентрация была низкой, в микроклонив отмечено отмирание листьев и потеря тургора верхушек прироста. На субстрате с высоким содержанием солей Na2CO3, NaHCO3, NaCl все растения варианта погибли уже на 20-й день после пересадки.

Что касается устойчивости к содового засоления, то, как оказалось, концентрации 0,4-0,8% Na2CO3 и 0,2% NaHCO3 является летальным или близкими к ним. Хлориды, внесенные в количестве 1,0%, уже значительно повлияли на развитие растений, однако для экспресс-диагностики растений работу над подбором концентраций следует продолжить.

Таким образом, среди исследуемых концентраций можно выделить летальные для обоих сортов — 0,4-0,8% Na2CO3 и 0,2% NaHCO3, 1,5% NaCl, а использованные концентрации CaCO3 и сульфатов является скорее адаптивными для микроклонив. Следует отметить, что в условиях культивирования in vitro виноград сортов Кречунел 2 и 101-14 показывает подобную реакцию на содовое засоления, а для селекционных подвойных сортов Добрыня и Таировское 1 отметили существенное снижение изученных показателей. Виноград сорта Таировское 1 является наиболее устойчивым ко всем типам засоления, по сравнению с сортом Добрыня.

Перспектива использования молекулярно-генетических исследований генома винограда очевидна. Это получение данных о происхождении и родстве сортов винограда, которые в процессе многовековой селекции распространились во всем мире и получили множество синонимических названий. Оценить систематику уже имеющихся древних сортов, а также предотвратить бесконтрольное размножение новых сортов можно путем идентификации и паспортизации генотипов растений, что приведет к созданию единого мирового банка данных, который будет содержать информацию о аборигенные сорта, древние и современные сорта и клоны винограда. Единый банк данных поможет сохранить генетические ресурсы растений, избежать нарушения авторских прав оригинаторов, сохранить исторически ценные культурные сорта винограда и будет способствовать интенсивному развитию мирового виноградарства и виноделия.

Наличие фундаментальных знаний, как правило, является необходимым условием при создании тех или иных прикладных воплощений научных достижений и внедрения их в практику. На данном этапе развития генетики и селекции необходима глобальная модернизация методологической базы, а именно внедрение в производство современных научных разработок. Неотъемлемой составляющей-вом этого связь классических генетических и молекулярно-генетических исследований и сельскохозяйственного производства.

Нашими исследованиями на основе гибридологического анализа генотипов родительских и прародительских сортов и их гибридов удалось подтвердить закономерности наследования некоторых качественных признаков («гроздь: по размеру», «гроздь: по плотности», «ягода: по размеру», «ягода: колирш-корки» ) и установить типы взаимодействия соответствующих генов. Определение генотипов растений по качественным признакам может быть использовано для генотипа-ния сортов винограда, для уточнения происхождения сортов, а также для оптимального подбора исходных селекционных форм по господарськоциннимы свойствами.

Получена информация о генотипов сортов и гибридов, а также типов взаимодействия генов углубляет представление о наследования качественных признаков винограда для селекционной практики. Однако определение генотипов особей и составления генотипических формул является сложной задачей из-за отсутствия единой системы определения генов и незначительного количества подтвержденных гипотез относительно возможных механизмов наследования признаков винограда.

Отдельные авторы предлагают обозначения генов качественных признаков винограда [3, 4], однако единой общепринятой системы обозначения генов пока нет.

Такие исследования необходимо привести к единой теоретической основы, в которой будут выявлены типы взаимодействия генов, обуславливающих проявление важных ампелографической признаков, идентифицированы гены, кодирующие данные признаки, и унифицированная единая система определения генов господарськоцин-ных признаков винограда.

Современные биотехнологии развиваются в двух основных направлениях: ДНК-технологии (оценка генетического разнообразия, распределение генотипов по генетической родством; селекция с помощью молекулярных маркеров; идентификация сортов, создание базы данных аллельных состояния ДНК-локусов сортов; лабораторная апробация и диагностика) и культура тканей шуйго (сохранение генетического разнообразия ресурсов растений и др.). [5, 6, 7, 8, 9].

Нами проведено исследование молекулярно-генетического полиморфизма гибридных популяций сеянцев винограда с помощью микросате-летних маркеров (рис. 2.). Полученные данные по аллельных характеристик МС-локусов сравнивались с оценкой морфобиологические характеристик гибридной популяции сеянцев, при этом была выявлена ??зависимость между но-льным вариантами микросателлитных локусов и проявлением морфобиологические признаков. При сравнении молекулярно-генетического полиморфизма аллелей микросателлитных локусов и морфобиологические показателей выявлено умеренный взаимосвязь между фенотипом «открытое расположение лопастей верхних листовых вырезов» и геном 208 п.о. локуса VMC2h4 (г = 0,42) (хромосома 12).

Рис. 2. Результаты электрофореза продуктов амплификации ДНК гибридной популяции сеянцев за микросателлитных локусов VMC2 h4 (М — молекулярный маркер pBR 322 DNA / BsuRl;

П — родительской сорт Пифос; Р — родительской сорт Рубин Таировское;

1 — 12 — гибриды)

Проведено исследование генетического полиморфизма сортов и клонов винограда, что позволило выявить наиболее типичные аллеля, оценить аллельных состав локусов и получить ДНК-маркерную систему для характеристики ценных генотипов винограда. На основе молекулярно — генетического анализа подобранная ДНК-маркерная система для характеристики генотипов винограда, с помощью которой возможно представить генотипы в виде генотипических формул. Однако необходимо отметить, что использование ДНК-паспорта необходимо сочетать с полным описанием морфобиологические характеристик, особенно при регистрации клонов.

В исследованиях используется кластерный анализ генетической сходства сортов и клонов винограда, который позволяет подтвердить их родство делением на дендрограми генотипов в субкластеры, определить различия между особями с целью идентификации сортов и дифференциации клонов и предоставляет возможность отбора оптимальных родительских пар для селекции.

Выводы: 1. Разработаны питательные среды и доказана возможность получения с их помощью полноценных растений виноград недозрелых семян, что будет способствовать получению раннеспелых крупно-плодных генотипов винограда.

Разработан состав питательных сред и показано пригодность метода культивирования in vitro для ускоренной оценки генотипов подвойных сортов винограда на засухоустойчивость и устойчивость к различным типам засоления.

На основе молекулярно-генетического анализа подобраны ДНК-маркерную систему для характеристики генотипов винограда.